Formazione di nanoparticelle intracellulari con tomografia nano-computerizzata
Formazione di nanoparticelle intracellulari con tomografia nano-computerizzata.
Attualmente è difficile osservare direttamente la formazione di nanostrutture intracellulari in laboratorio.
In un nuovo rapporto, Miaomiao Zhang e un gruppo di ricerca in chimica, ingegneria medica e scienza e tecnologia, in Cina, hanno utilizzato una piccola molecola progettata razionalmente abbreviata NBC-Iod-CBT (abbreviazione di 4-nitrobenzil carbammato-Cys (SEt ) -Asp-Asp-Phe (iodio) -2-ciano-benzotiazolo) e formazione di nanoparticelle intracellulari direttamente osservata con tomografia nanocomputata (nano-TC).
Durante gli esperimenti, i meccanismi di riduzione del glutatione (GSH) e di scissione della nitroreduttasi (NTR) hanno fatto sì che le molecole NBC-Iod-CBT subissero una reazione di condensazione a clic e autoassemblamento di nanoparticelle (NP) come Iod-CBT-NP.
Quando il team ha condotto l’imaging nano-CT di cellule HeLa trattate con NBC-Iod-CBT in laboratorio, hanno mostrato l’esistenza di Iod-CBT-NP autoassemblati nel loro citoplasma.
La nuova strategia è ora pubblicata su Science Advances e aiuterà gli scienziati della vita e i bioingegneri a comprendere i meccanismi di formazione delle nanostrutture intracellulari.
Formazione di nanoparticelle intracellulari – Una strategia intelligente
L’assemblaggio di nanostrutture utilizzando piccoli precursori molecolari all’interno delle cellule è una strategia intelligente con grandi vantaggi nell’imaging molecolare e nella somministrazione di farmaci.
Piccole molecole possono essere facilmente assorbite dalle cellule, ma vengono anche eliminate rapidamente.
Al contrario, le nanostrutture con agenti terapeutici hanno tempi di ritenzione più lunghi nelle cellule con maggiore potenza. Tuttavia, è molto più difficile per una cellula assumere una nanostruttura rispetto a una piccola molecola.
Gli scienziati quindi attivano le nanostrutture per l’assorbimento cellulare modificando la superficie cellulare mirando a “testate”, ma tali modifiche possono ridurre la riproducibilità del nanocomplesso.
Di conseguenza, un metodo intelligente sviluppato di recente mira a formare nanoparticelle intracellulari, in cui le colture cellulari incubate con un piccolo precursore molecolare avranno una nanostruttura, per applicazioni entusiasmanti nell’imaging molecolare e nella somministrazione di farmaci.
Tuttavia, è ancora difficile distinguere tra le nanostrutture formate artificialmente dalle strutture cellulari intrinseche.
Per ottenere ciò, Zhang e team hanno prima hanno progettato un precursore di piccole molecole contenente iodio (iod), poi hanno sottoposto il composto ad autoassemblaggio intracellulare istruito da enzimi per formare le nanoparticelle di interesse e hanno utilizzato la nano-CT (tomografia nanocomputata) per osservare le nanoparticelle intracellulari.
Formazione di nanoparticelle intracellulari – L’esperimento
La piccola struttura molecolare iodata NBC-Iod-CBT aveva un design razionale costituito da quattro parti, che includevano
- Un substrato di 4-nitrobenxil carbammato (NBC) per scomporre la nitroreduttasi (NTR),
- Un motivo di cisteina latente (Cys) e strutture 2-ciano-benzotiazolo (CBT) per reazioni di condensazione del clic CBT-Cys,
- Una regione iodata per il miglioramento del contrasto della tomografia computerizzata e
- Due motivi di acido aspartico idrofilo per una buona solubilità in acqua in condizioni fisiologiche
Quando il composto è entrato nelle cellule tumorali ipossiche iperesprimenti la nitroreduttasi (NTR) (prive di livelli adeguati di ossigeno), si sono autoassemblate per formare nanoparticelle (NP) note come Iod-CBT-NP.
Per indurre la formazione di nanoparticelle innescate da nitroreduttasi (NTR) in laboratorio, gli scienziati hanno incubato la piccola molecola NBC-Iod-CBT con soluzioni saline tamponate e hanno aggiunto la soluzione di nitroreduttasi per due ore per formare nanostrutture con assorbanze visibili tra 500-700 nm .
Quando Zhang e team hanno aggiunto alla soluzione un inibitore della nitroreduttasi noto come dicumarina, le assorbanze visibili delle miscele sono diminuite, confermando la formazione di nanostrutture in presenza di nitroreduttasi.
Utilizzando immagini di microscopia elettronica a trasmissione, il team ha osservato la comparsa di nanoparticelle e ha utilizzato la cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) e la spettrometria di massa di desorbimento / ionizzazione laser assistita da matrice ad alta risoluzione per confermare la formazione di Iod-CBT-NP.
Zhang successivamente ha utilizzato immagini nano-TC tridimensionali (3-D) della miscela con una microscopia a raggi X morbida nano-TC per ricostruire infine le immagini nano-TC 3-D, in cui diversi componenti del composto mostravano diverse capacità di assorbimento.
In questo modo, l’esperimento ha facilitato il composto di interesse NBC-Iod-CBT a subire l’autoassemblaggio attivato da NTR per formare le nanoparticelle previste (Iod-CBT-NP) in laboratorio.
Formazione intracellulare di Iod-CBT-NP e imaging nano-CT mediante microscopia a raggi X molli
Zhang ha poi studiato lo stesso processo sperimentale per indurre l’autoassemblaggio delle nanoparticelle all’interno delle cellule.
Il composto di interesse (NBC-Iod-CBT) aveva una maggiore selettività nei confronti della nitroreduttasi, per prevenire così ogni possibile interferenza intracellulare in presenza di altri costituenti intracellulari quali biotioli, ossidanti e amminoacidi.
Le cellule tumorali HeLa cervicali umane tipicamente sovraesprimono nitroreduttasi (NTR) in condizioni ipossiche (prive di livelli adeguati di ossigeno), raggiungendo i livelli sperimentali più elevati entro otto ore.
Quando Zhang ha incubatato le cellule HeLa ipossiche con la piccola molecola NBC-Iod-CBT, hanno osservato l’eventuale formazione di nanoparticelle all’interno delle cellule HeLa ipossiche.
Utilizzando immagini al microscopio elettronico delle cellule, hanno mostrato l’esistenza delle nanoparticelle come previsto nel citoplasma cellulare.
Per osservare direttamente le nanoparticelle di interesse (Iod-CBT-NP) all’interno delle cellule, il team ha trattato sperimentalmente le cellule HeLa ipossiche e le ha fotografate utilizzando la microscopia a raggi X morbida nano-CT.
Hanno quindi utilizzato cellule HeLa ipossiche pretrattate con dicumarina o normossia (livelli normali di ossigeno) come due controlli positivi e cellule HeLa non trattate con ipossia o normossia come due controlli negativi.
I risultati hanno indicato la formazione delle nanoparticelle Iod-CBT nel citoplasma delle cellule HeLa ipossiche.
Quando hanno sottoposto queste cellule a un trattamento con inibitore della nitroreduttasi, il contrasto CT del citoplasma è diminuito.
Il team ha ricostruito le proiezioni 2-D delle cellule per ottenere immagini nanoCT 3-D.
Utilizzando il coefficiente di assorbimento lineare (LAC) o il coefficiente di attenuazione lineare, Zhang ha confermato la fattibilità della formazione di nanoparticelle intracellulari.
Formazione di nanoparticelle intracellulari – Prospettiva
In questo modo, Miaomiao Zhang e colleghi hanno progettato razionalmente un costrutto NBC-Iod-CBT di piccole molecole iodate per formare e osservare direttamente le nanoparticelle all’interno delle cellule utilizzando la nano-CT.
Dopo esperimenti di prima mano condotti in vitro, il team ha condotto ulteriori studi sul citoplasma delle cellule HeLa che esprimono nitroreduttasi.
Utilizzando tecniche analitiche, il team ha mostrato la formazione di nanoparticelle (Iod-CBT-NP) nelle cellule HeLa ipossiche trattate con NBC-Iod-CBT di piccole molecole.
Hanno verificato il loro metodo utilizzando il coefficiente di assorbimento lineare e confermato la fattibilità della formazione di nanoparticelle intracellulari.
Questo lavoro aiuterà i ricercatori a ottenere informazioni più approfondite sulla formazione di nanostrutture intracellulari con applicazioni significative in nanomedicina e bioingegneria.